Contexte :
 
Le projet vise à modéliser, à l'aide d'une approche multi-échelles les processus moléculaires impliqués dans la recombinaison homologue.

RecA/Rad51 et la recombinaison homologue

La recombinaison homologue est un des processus vitaux de la gestion du patrimoine génétique. Tout d'abord, elle permet de créer de la diversité génétique en brassant les gènes provenant des chromosomes parentaux. C'est également grâce à ce même processus que les lésions «double brin» de l'ADN, souvent provoquées par l'action des radiations ionisantes, peuvent être réparées afin de permettre la transmission fidèle du chromosome aux cellules filles. A ces rôles «biologiques» de la recombinaison homologue s'ajoute depuis peu un intérêt appliqué important, concernant l'utilisation technologique de «l'outil recombinaison», sollicité par la transgénèse.
 
In vitro, une seule protéine est suffisante à promouvoir la recombinaison : RecA chez E. Coli et Rad51 chez l'homme. Ces protéines, dont la structure est extrêmement conservée au cours de l'évolution, polymérisent sur un simple brin d'ADN pour former un nucléofilament, puis elles en cherchent la séquence homologue dans tout le génome (ADN double brin) de la cellule. Il se forme ainsi un filament nucléoprotéique RecA impliquant transitoirement trois brins d'ADN, dans lequel est effectuée la reconnaissance des séquences qui permet l'initiation de l'échange des brins (Fig. 1)

Figure 1 : Représentation schématique du cycle de recherche d’homologie et d’échange de brins : les brins A ont la même séquence, le brin B est le complémentaire. La protéine RecA est représentée par des ovales verts.

Mécanisme de la recombinaison homologue

La recombinaison homologue, et en particulier l’action de RecA, ont été étudiées intensivement au cours des dix dernières années (Takahashi 1994, Kuzminov 1999, Dutreix 2003), par des méthodes combinant les outils traditionnels de la biologie moléculaire, les analyses structurales, la spectroscopie, la microcalorimétrie, la modélisation moléculaire. De nombreux éléments du mécanisme impliquant RecA sont également valables pour Rad51 et les eucaryotes supérieurs, au moins au niveau qualitatif et mécanistique.

De gros progrès ont été effectués, en particulier sur le plan structural, mais les mécanismes précis de la recombinaison et en particulier ses aspects dynamiques demeurent largement inconnus. Or l’efficacité de la recherche d’homologie est remarquable : par exemple dans les cellules eucaryotes, dont la taille du génome est de l’ordre de 10⁹ paires de bases, une séquence homologue de quelques centaines de bases peut être retrouvée en 10 minutes en moyenne. Aucune des hypothèses proposées jusqu’à présent, faisant intervenir une recherche processive le long de l’ADN ou des processus d’association-dissociation, ne semble être compatible avec l’ensemble des résultats expérimentaux, en particulier si l’on compare les résultats obtenus in vitro et in vivo.

In vivo, l’ADN n’est présent sous forme de simple brin que de façon exceptionnelle, durant la réplication ou à l’occasion de cassures simple et double-brin, très dangereuses pour la survie de la cellule et même de l’organisme dans le cas des eucaryotes supérieurs puisqu’elles peuvent, si elles sont mal gérées, donner lieu à des réarrangements chromosomiques potentiellement sources de cancers. RecA ou Rad51 sont capables de polymériser sur le simple brin, de façon fortement coopérative : en l’absence d’ADN, RecA peut former des multimères de quelques unités, mais l’interaction avec l’ADN stabilise fortement le complexe et conduit à une polymérisation rapide qui peut s’étendre sur des milliers de bases. Dans le complexe avec RecA, l’ADN adopte une structure hélicoïdale étirée d’un facteur 1,5 et partiellement déroulée par rapport à la structure canonique de l’ADN double brin nu.

Reconnaissance d'homologie

Une fois complexé sur de l’ADN simple brin, RecA est capable de recruter une deuxième molécule d’ADN, double brin cette fois, pour former un complexe à trois brins impliqué dans la « synapse ». Ce complexe est au cœur de la « reconnaissance d’homologie ». En effet, il n’est stable que si l’ADN simple brin est complémentaire d’un des brins du double brin associé. Le double brin présente dans le complexe le même pas que le simple brin, c’est à dire qu’il est étendu et déroulé. On pense que ce changement topologique joue un rôle essentiel dans la reconnaissance d’homologie, en rendant plus accessibles les bases qui portent le code génétique. Dans le double brin nu, ces bases sont en effet enfermées au cœur de la double hélice, et incapables d’interagir avec d’autres molécules d’ADN, sauf pour des séquences bien particulières (cas des ADN triplex). Une fois ce nucléofilament triplex amorcé (sur une zone courte de quelques paires de bases, Dutreix 2003), l’échange de brins peut se propager et, fait exceptionnel dans les processus de reconnaissance moléculaire du vivant, « traverser » des zones hétérologues relativement longues. Il s’agit donc d’un processus de reconnaissance moléculaire qu’on pourrait appeler « à longue portée », capable de gérer un certain degré d’approximation dans l’identité moléculaire, pourvu que certaines zones (en particulier celles de l’initiation de l’échange) soient parfaitement homologues.

Apport des équipes impliquées dans le projet pour la compréhension du mécanisme de reconnaissance

Objectifs :

Nous sommes convaincus qu’une double approche combinant expérience et modélisation multi-échelles est nécessaire pour appréhender le mécanisme de recherche d'homologie dans la recombinaison homoloque. La combinaison des approches théoriques permettra de couvrir l’ensemble des échelles de temps et d’espace, allant de la structure à une échelle atomique à une molécule de plusieurs milliers de bases. En particulier, la modélisation moléculaire sera utilisée pour fournir aux simulations de Monte-Carlo des cartes énergétiques réalistes, et pour « faire le tri » dans les nombreux modes de déformation et « chemins » envisageables à priori lors de la recherche d’homologie. Les potentiels et les modèles seront affinés par des aller-retour entre les résultats du Monte Carlo, la modélisation moléculaire, des expériences de Biologie Moléculaire traditionnelle menées dans l’équipe de M. Dutreix (voir par exemple Biet 03), des expériences de molécules uniques (voir par exemple Cluzel 96) pour le “calibrage” des potentiels de déformation de l’ADN duplex nu) et les analyses de biologie structurale.

Au niveau des mécanismes biologiques, on attend du projet une meilleure compréhension des étapes clés de la recombinaison homologue, qui reste un des processus les plus importants et les plus fascinants de la gestion du patrimoine génétique. RecA est une protéine simple structurellement, mais les fonctions qu’elle effectue sont particulièrement complexes, et mettent en jeu à la fois des effets très locaux, tels que la présentation des bases dans le complexe à trois brins, et des effets à grande échelle, tels que la capacité à propager de façon directionnelle une jonction de Holliday, et à « traverser » des zones non-homologue étonnamment étendues. Pour cet aspect, plusieurs hypothèses s’affrontent, mettant en jeu soit des effets topologiques, soit des vagues d’hydrolyse d’ATP, sans qu’aucun résultat expérimental n’ait pu pour l’instant trancher (Klapstein 00). Cette multiplicité de fonctions ne pourra être à notre avis décrite que par une approche multi-échelles.

Sur le plan des applications, la compréhension des effets de séquence répétées est très importante pour de nombreux problèmes d’intérêt biologique et médical (réparation des cassures double-brin et oncogénèse, amélioration de la radiothérapie, mutagénèse assistée par recA pour des applications de biotechnologie).

Enfin, l’approche multi-échelles proposée ici pourrait servir par la suite de prototype pour une nouvelle direction ambitieuse de la modélisation des systèmes biologiques. Les simulations de Monte Carlo dynamique telles que celles que nous proposons ici constituent un outil privilégié, voire pour l’instant quasi-indispensable pour rendre compte de la dimension DYNAMIQUE de ces systèmes complexes, et en particulier pour tenir compte du caractère foncièrement Brownien de la dynamique à l’intérieur de la cellule. Le système abordé dans ce projet, plus simple qu’un organite cellulaire, mais déjà significativement plus complexe et étendu qu’un simple complexe protéique ou qu’un complexe entre l’ADN et un site de fixation de promoteur, peut constituer une étape importante dans ce processus de modélisation cellulaire multi-échelles.

Références bibliographiques


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Biet E., R. Maurisse, M. Dutreix and J.-S. Sun. 2001. Stimulation of RecA-mediated D-loop formation by oligonucleotide-directed triple-helix formation : guided homologous recombination (GOREC). Biochemistry 40: 1779-1786 

Biet, E., J.-S. Sun and M. Dutreix. 2003. Stimulation of D-loop formation by polypurine/polypyrimidine sequences. Nucleic Acids Res. 31: 1006-1012 

Cluzel, P., A. Lebrun, C. Heller, R. Lavery, J.L. Viovy and D. Chatenay. 1996. DNA: An Extensible Molecule. Science 271: 792-794

Dutreix, M. 1997. (GT)n repetitive tracts affect several stages of RecA-promoted recombination. J. Mol. Biol. 273: 577-586 

Dutreix, M., R. Fulconis and J.L. Viovy. 2003. The search for homology : a paradigm for molecular interactions? Complexus 1: 89-99        retour ci-dessus
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Gendrel, C.G., A. Boulet and M. Dutreix. 2000. (CA/GT)(n) microsatellites affect homologous recombination during yeast meiosis. Genes Dev. 14: 1261-1268 

Klapstein, K. and R. Bruinsma. 2000. RecA force generation by hydrolysis waves. J. Biol. Chem. 275: 16073-16083 

Takahashi, M and B. Nordén. 1994.  Structure of RecA-DNA complex and mechanism of DNA strand exchange reaction in homologous recombination. Adv Biophys. 30: 1-35

Kuzminov A. 1999. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda. Microbiol Mol Biol Rev. 63: 751-813